課程概述 |
本課程於是設計一系列連貫性的實驗,並依操作技術的不同歸類在三個獨立的領域:其一為DNA,其二為RNA,其三為蛋白質。 課程的架構,係使用同一個基因,先進行重組DNA的操作 (第二章),構築一個表現質體,再利用此表現質體表達出RNA,來進行北方雜合分析 (第三章),最後利用該表現質體來表現大量的蛋白質,於是可以進行蛋白質的純化與檢定 (第四章)。 為了讓初學者容易得到實驗結果,以建立初學者的信心與興趣,於是選擇大腸桿菌 (Escherichia coli) 之 -glucuronidase (GUS) 基因 (uidA 或稱 gusA) 作為本實驗課程的主角。 該基因產物為GUS蛋白質,相當穩定而不易降解,並為一水解酵素,有簡易的測定方法;且可使用市售的基質 (substrate) 在原位 (in situ) 顯現出酵素的活性,以肉眼即可檢測其產物,非常便利。 基因選定之後,我們於是構築了兩種質體 (如表0.1所示),包括pBlueGus及其表現載體pQG11 (其構築流程顯示於圖0.1)。 簡而言之,首先利用聚合連鎖反應 (polymerase chain reaction) 合成GUS基因,此基因長度為1,807 bp,並於5’ 及3’ 端點分別接上BamHI及HindIII限制的切割序列,然後分別使用pBluescript SK(-) 及pQE31為載體及表現載體,經BamHI及HindIII切之後,將GUS基因與pBluescript連接,或連接至pQE31核糖體結合序列 (ribosome binding sequence) 以及連續六個組胺酸 (histidine) 解碼序列 (6xHis) 之下游。為了確保GUS基因的忠實度 (fidelity),防止聚合連鎖反應合成基因片段出現失誤的可能性,於是在表現載體pQG11構築完成之後,利用所表現的蛋白質來測定酵素活性,所使用的檢測法是使用p-nitrophenyl -D-glucuronide為基質,經反應後於分光光度計測量415 nm之吸光。 |